هدف از اين تحقيق بررسي ايمني زايي ژنهاي L₇/L₁₂ و P39 در موشهاي Balac است. بنابراين پس از جداسازي و تكثير ژنهاي فوق مراحل زير در اين تحقيق انجام گرفت.
۱- لكون نمودن ژنهاي فوق در يك ناقل انتقال دهنده Cleaning vector
۲- تعيين ترادف نوكلئوتيدي ژنهاي جداشده و مقايسه آن با ژنهاي L₇/L_12
۳- كلون نمودن ژنها در پلاسميد بيان كننده پروكاريوني Procaryotic expression vector
۴- توليد و تخليص پروتئينهاي L₇/L₁₂ و P39
۵- كلون نمودن آنها در پلاسميد بيان كننده اوكاريوتي Eucaryotic expression vector
۶- هاري كردن پلاسميدهاي فوق از آندوتوكسين
۷- تزريق پلاسميدها، بسويه واكنش و سويه بيماريزا بروسلاآبورتوس به موش Balb/C
۸- سنجشهاي ايمونولوژيك
باكتريها و پلاسميدهايي كه براي انجام اين پايان نامه استفاده دشه اند بترتيب زير مي باشند:
باكتريها: بروسلاآبورتوس سويه هاي ۱۹S و ۵۴۴ اشديشيالكي سويه
اشريشيالكي سويه BL21 – اشريشياكي سويه BL21(DE3(Plyss
پلاسميرها: PGEX4T1 – PRT 28a – SK+(pSK) – Pblue Script-PCDNA3

جداسازي كروموزوم بروسلا آبورتوس ۱۹S:
براي تكثير ج داسازي ژنهاي L₇/L₁₂ و P39 ابتدا كروموزوم باكتري جداسازي گرديد.
مواد:
بافر TE:
Tris – Hel ۱۰mm

EDTA ۱٫۰mm

‍PH بافر را پس از تهيه برروي ۸ تنظيم مي نمائيم.

روش :

ابتدا محيط برنسط برات را تهيه و استريل نموده و ml5 از محيط را با بروسط آبورتوس سويه ۱۹S تلقيح مي نمائيم. پس ۴۸ تا ۷۲ ساعت باكتريها رشد كرده و كدورت مناسبي را پيدا مي كند. بقيه مراحل تخليص كروموزوم بشرح زير است:
۱- ۵/۱ ميلي ليتر از سوسپاستيون فوق را مدت ۲ دقيقه در rpm5000 سانتريفوژ مي نمائيم. محلول رويي را دور مي ريزيم.
۲- Ml576 از بافر TE را بر روي رسوب باكتري اضافه كرده و رسوب را در بافر حل مي نمائيم. سپس ml30 از SDS(10%) و ml3 از پروئيناز K (mg/ml20) را افزوده و بمدت يكساعت در دماي ^۰C37 نگهداري مي نمائيم.
۳- پس از مخلوز Ml100 از (M5)NaCl از محلول CTAB/NaCl بميزان Ml80 اضافه كرده و بمدت ۱۰ دققيق در ^۰C65 انكوبه مي كنيم.
۴- هم حجم مخلوط بالا از تركيب كلروفرم – ايزوآميل (۱/۲۴) به مخلوط افزوده و سپس از مخلوط بمدت ۵ دقيقه در rpm10000 سانترفوژ مي كنيم. محلول رويي را به لوله ديگر منتقل مي نمائيم.
۵- هم حجم محلول روئي ترميب فنل – كلروفرم – ايزوآميل (۱/۲۴/۲۵) پس از مخلوط بمدت ۵ دقيقه در vpr10000 سانتريفوژ كرده و محلول رويي به لوله ديگري منتقل مي نمائيم.
۶- هم حجم محلول روئي ايزوپروپانل اضافه نموده و مخلوط مي كنيم. پس از چند دقيقه DNA كروموزومي ته نشين شده كه مي توان بات يك پيپت پاستور آنرا جمع آوري نمائيم.
۷- رسوب DNA كروموزومي را با الكل ۷۰% شستشو داده و پس از خشك شدن در مجاورت هوا در Ml100 از بافر TE حل مي نمائيم.